HDX流程是将氘代后的蛋白在0°C、pH 2.5的条件下进行酶切，随后将肽段样品进入LC-MS做多元化的剖析以取得肽段水平HDX信息。HDX法，行将完好蛋白质注入质谱仪，在气相中碎裂并确认碎片的氘化水平。经过比较接连碎片的氘化水平，一般能确认单个氨基酸残基的交流或维护程度(即氨基酸水平分辨率)。但是，磕碰诱导解离(CID) 引起很多H/D scrambling(图1)2，导致氘代位点定位失真，因而一般不适用于top-down HDX-MS 丈量。电子捕获解离/电子搬运解离(ECD/ETD)可以有很大成效防止scrambling现象，但其对蛋白质序列内部掩盖较低，然后在这些区域的HDX分辨率较低

　　图2.装备UVPD的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪原理图。

　　Top-down HDX剖析是经过接连在线O，然后与酸性淬灭(quench)溶液混兼并直接注入质谱仪来进行的，本试验中氘代和淬灭时刻由混合毛细管的长度和打针溶液的打针器的流速决议。作者选取肌红蛋白(myoglobin)作为规范蛋白，首要对完好蛋白的氘代水平进行了评价。如图3，氘符号后质谱检测到质荷比位移169 Da，而肌红蛋白中最大可氘代残基数目为277个，由此算出有108个酰胺氢处于结构中的维护状况。这与肌红蛋白晶体结构中112个骨架酰胺氢参与构成氢键的效果相吻合。

　　在筛选出单一电荷态的肌红蛋白母离子后，作者运用213nm激光对肌红蛋白进行UVPD碎裂(脉冲次数2-62)，该进程是在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪的双压线性离子阱的低压池中进行的，发生的碎片在Orbitrap质量剖析器中检测。此外，作者也运用了ETD碎裂(反应时刻1-25ms)作为对照和互补。图4A为包括有用氘代数据的碎片离子掩盖图。ETD和UVPD之间共有的碎片离子显示出相同的氘代值，证明UVPD中没发生scrambling。

　　Top-down HDX数据剖析经过 HDX Match软件进行。未氘代的碎片离子峰是重要的零点，用于核算氘代位移量，但是未氘代碎片中a、x、y离子的同位素拟合较差。因而作者优化了碎片离子峰型拟合算法，称之为“+ 0/1/2”(即规范碎片离子和由其衍生的添加1或2 Da 的离子的混合物)和“- 0/1/2”(即规范碎片离子和由其衍生的丢失1或2 Da的离子的混合物)，其可以拟合出该碎片离子理论的谱图，由此作为零点核算氘代位移值。经过该优化后的算法核算得到了碎片的氘代值，并由此核算出了残基水平氘代值(图4B)。将氘代值映射到肌红蛋白的晶体结构上(图5)，发现top-down HDX得到的氘代状况与晶体结构有必定的吻合度。

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